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細(xì)胞復(fù)蘇失敗原因分析——復(fù)蘇篇

更新時(shí)間:2025-02-06瀏覽:319次

細(xì)胞復(fù)蘇成敗和凍存及復(fù)蘇操作密切相關(guān)。上個(gè)星期和大家分享了細(xì)胞凍存方面容易出錯(cuò)的細(xì)節(jié),詳見(jiàn)《細(xì)胞復(fù)蘇失敗原因分析——凍存篇》。本篇主要從復(fù)蘇角度分析,排查復(fù)蘇過(guò)程中容易出現(xiàn)的問(wèn)題。




復(fù)蘇步驟

同樣,我們先復(fù)習(xí)一下復(fù)蘇步驟:

1. 提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃,培養(yǎng)基復(fù)溫,離心機(jī)設(shè)置好轉(zhuǎn)速;

2. 準(zhǔn)備一個(gè)15ml離心管并加入適量培養(yǎng)基。

3. 取出凍存管,浸入水浴鍋迅速搖晃使細(xì)胞在2min內(nèi)充分融化;

4. 將細(xì)胞懸液緩慢滴入提前加了培養(yǎng)基的離心管,1000rpm 3min離心;

5. 棄上清,重懸細(xì)胞并接種至培養(yǎng)器皿中,放入培養(yǎng)箱。






圖片

復(fù)蘇常見(jiàn)的錯(cuò)誤操作

圖片

1. 若液氮或冰箱距離水浴鍋較遠(yuǎn),沒(méi)有做保冷措施

為防止細(xì)胞在運(yùn)輸路上開(kāi)始融化(特別是夏季),凍存細(xì)胞需要放在干冰或冰盒上運(yùn)送至水浴鍋。


2. 運(yùn)輸凍存管時(shí)手觸碰到細(xì)胞部分或放在了口袋里

請(qǐng)勿用手觸碰凍存管身,避免局部溫度升高導(dǎo)致細(xì)胞開(kāi)始融化。應(yīng)捏住管蓋或放在容器中運(yùn)輸


3. 采用錯(cuò)誤的方式融化細(xì)胞

不要用手捂化(搓熱也不行),手心溫度不夠高,細(xì)胞受熱不均勻且降溫速度太慢導(dǎo)致細(xì)胞死亡。


4. 水浴時(shí)沒(méi)有嚴(yán)格控制時(shí)間,直接放水里靜置,沒(méi)有晃動(dòng)促進(jìn)融化

細(xì)胞復(fù)蘇需遵循“快融"原則,建議在2min內(nèi)將細(xì)胞充分融化,水浴時(shí)間越長(zhǎng)活率越低。比較好的方法是捏住管蓋,將管身浸沒(méi)水中快速搖晃,促進(jìn)細(xì)胞融化。切忌將凍存管靜置在水浴中。


5. 水浴結(jié)束時(shí)管內(nèi)還有較大冰塊

如果沒(méi)融化完quan,還有比較大的冰塊,也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。一方面冰塊中的細(xì)胞緩慢升溫而死亡,另一方面冰塊導(dǎo)致已融化的細(xì)胞被低溫?fù)p傷。

有的同學(xué)說(shuō)2min的水浴很難讓細(xì)胞融化,那么咱們可以將水浴鍋溫度提高至39度(小編親測(cè)可行),搖晃速度加快,擔(dān)心污染可以將凍存管放在一次性PE手套內(nèi)再進(jìn)行水浴。水浴鍋里的水不能太少,否則凍存管放入水后局部溫度會(huì)達(dá)不到預(yù)設(shè)溫度,導(dǎo)致融化過(guò)慢。


6. 細(xì)胞融化后沒(méi)有離心去除DMSO

有的同學(xué)復(fù)蘇細(xì)胞會(huì)在細(xì)胞融化后加10倍培養(yǎng)基稀釋,不離心直接培養(yǎng),等細(xì)胞貼壁后換液。雖然這對(duì)于好養(yǎng)的貼壁細(xì)胞是可行的,但不是長(zhǎng)遠(yuǎn)之計(jì),也不適用于懸浮細(xì)胞。DMSO對(duì)細(xì)胞有一定毒性,有些細(xì)胞對(duì)DMSO比較敏感,如HL-60細(xì)胞等。如果你不清楚自己的細(xì)胞是否對(duì)DMSO敏感,那么還是離心去除上清最為保險(xiǎn)。


以上由小尚多年經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而來(lái),結(jié)合凍存篇,基本可以解決所有復(fù)蘇失敗的問(wèn)題。如果還有沒(méi)提及的知識(shí)點(diǎn),歡迎同學(xué)們可以在評(píng)論區(qū)補(bǔ)充~


 

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